L’optimisation du transgène peut répondre à plusieurs besoins, tels que l’adaptation à la capacité d’encapsidation du vecteur ou encore l’amélioration de son expression.

Pour permettre le transport du vecteur vers les cellules cibles et que l'expression du transgène fonctionne, le gène d’intérêt doit être adapté à la capacité d’encapsidation du vecteur.^(12,14) Pour le rAAV, cette capacité d’encapsidation est d’environ 5,0 kb.⁽¹⁴⁾ Si un transgène dépasse cette taille, il peut être nécessaire de modifier l’ADN pour surmonter cette barrière.⁽¹¹⁾ En outre, l’expression du transgène peut potentiellement être améliorée par l’optimisation du transgène lui-même (par exemple, via l’optimisation des codons).⁽³⁾ Concernant la thérapie génique de l’hémophilie, plusieurs éléments doivent être pris en compte pour la sélection et l’optimisation des transgènes F8 ou F9.⁽¹¹⁾

Hémophilie A - Taille du gène F8

Le FVIII est codé par le gène F8, dont la taille est d’environ 7 kb. Cela dépasse la capacité d’encapsidation du rAAV et, par conséquent, l’ADN de F8 doit être réduit pour pouvoir être encapsidé dans le rAAV.⁽¹¹⁾

La structure du gène F8 est bien documentée et on sait qu’il comprend trois domaines A homologues, deux domaines C homologues et un domaine B unique.⁽¹⁵⁾ Les domaines A et C sont essentiels à l’activité procoagulante du FVIII, et, la délétion du domaine B ne semble pas altérer la fonction de la protéine.⁽¹⁵⁾ Des modèles explorant la délétion partielle du domaine B ont été étudiés.⁽²⁾ Il a été montré que la délétion partielle du domaine B du gène F8 entraînerait une augmentation des niveaux d’ARNm et une augmentation de la sécrétion de la protéine FVIII par rapport au gène F8 de type sauvage.⁽²⁾ Le facteur VIII recombinant dépourvu de domaine B (BDD) peut être utilisé comme facteur de remplacement pour le traitement des patients atteints d’hémophilie A⁽²⁾, et l’adoption d’une approche similaire consistant à utiliser l’ADN du F8-BDD pour la thérapie génique pourrait permettre de surmonter les restrictions d’encapsidation du rAAV.⁽¹¹⁾

Hémophilie B - Mutation par gain de fonction sur le gène F9

Le facteur IX est codé par le gène F9, dont la taille est d’environ 1,6 kb.⁽¹¹⁾ Ce petit gène peut être intégré dans la cassette d’expression du rAAV sans que sa taille ne soit modifiée.^{(2,11)
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L’optimisation du gène F9 pour la thérapie génique s’est principalement concentrée sur l’augmentation de l’expression génique après l’administration du transgène aux cellules cibles. Cela peut être réalisé en incorporant une mutation ponctuelle favorable dans le gène F9. Il a été montré que cette mutation ponctuelle (R338L), appelée F9-Padua, entraîne une augmentation de l’activité du FIX par rapport au FIX de type sauvage.^{(16,17)
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​​​​​​​Exemple d'optimisation des gènes F8 et F9 pour leur incorporation dans la cassette d’expression du rAAV. La taille du gène F8 de type sauvage dépasse la capacité d’encapsidation de la cassette d’expression du rAAV. La délétion partielle du domaine B a permis le développement  de vecteurs rAAV pour la thérapie génique de l’hémophilie A.⁽¹¹⁾ Le gène F9 WT peut être intégré dans la cassette d’expression du rAAV en raison de sa petite taille d’environ 1,6 kb. L’utilisation du transgène F9-Padua, un variant du gène F9 reposant sur une mutation d’un seul acide aminé (R338L), peut permettre d’utiliser une dose plus faible de vecteur.^{(11,18)
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BDD : délétion du domaine B ; ITR : répétition terminale inversée ; poly(A) : queue de polyadénylation A ; rAAV : virus adéno-associé recombinant ; WT : type sauvage

Figure adaptée de Crudele JM, et al. 2015⁽¹⁾, Doshi BS, Arruda VR. 2018⁽¹¹⁾, Simioni P, et al. 2009⁽¹⁷⁾, High KA, Roncaralo MG. 2019⁽¹⁸⁾, Nguyen ON, et al. 2016⁽¹⁹⁾ et Samelson-Jones BJ, et al. 2019⁽²⁰⁾.

Optimisation des codons des gènes F8 et F9

L’optimisation des codons des transgènes est une approche utilisée pour maximiser l’expression et le potentiel thérapeutique d’un transgène.⁽²¹⁾ La plupart des acides aminés sont codés par plusieurs codons (codons synonymes), et certains organismes et types de cellules présentent une préférence pour certains codons.⁽²²⁾ L’objectif de l’optimisation des codons est de sélectionner les codons synonymes pour lesquels les ARN de transfert sont les plus abondants.⁽²²⁾ Ceci peut en conséquence augmenter le taux et l’efficacité de la traduction.^{(22)
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Ainsi, l’expression des transgènes F8 et F9 peut être améliorée en utilisant la technique de l’optimisation des codons.⁽³⁾ L'intérêt de cette technique sur l'amélioration des niveaux d'expression du facteur VIII et IX a été montré sur différents transgènes F8^(2,16) et F9.⁽¹⁶⁾ Cependant, des données ont montré que l’optimisation des codons de F9 peut avoir un impact sur la conformation de la protéine et entraîner une cinétique de traduction différente de celle du facteur IX de type sauvage.⁽²²⁾ Ces changements imprévisibles nécessitent une étude plus approfondie.⁽²²⁾

Outre l’optimisation du transgène, la cassette d’expression peut encore être améliorée en tenant compte des promoteurs et des amplificateurs.⁽⁴⁾

Promoteurs

Les promoteurs sont essentiels à l’expression du transgène⁽¹⁰⁾, et peuvent être ubiquitaires ou spécifiques à un tissu.⁽⁴⁾

Des promoteurs ubiquitaires à action immédiate, peuvent être utilisés pour promouvoir l’expression dans de nombreux types de tissus. Le niveau d’expression peut varier selon les tissus et les types de cellules.⁽⁴⁾

Les promoteurs spécifiques des tissus ou des cellules permettent un meilleur contrôle de l’expression du transgène.⁽⁴⁾ La thérapie génique de l’hémophilie vise à établir l’expression du transgène F8 ou F9 dans les hépatocytes.⁽¹¹⁾ En utilisant des séquences promotrices provenant de protéines naturellement synthétisées dans les hépatocytes, l’expression de F8 et F9 peut être ciblée sur le foie avec une expression minimale dans d’autres tissus, ce qui réduit la probabilité d’une réponse immunitaire induite par le transgène.^(4,6) De plus, les promoteurs endogènes du gène thérapeutique offrent la possibilité de diriger l’expression vers les cellules pertinentes, au niveau et au moment appropriés.⁽²³⁾

Amplificateur
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Les amplificateurs renforcent l’activité des promoteurs en fournissant des sites de liaison pour les protéines régulatrices.⁽⁷⁾ Une étude in vitro des combinaisons amplificateur/promoteur pour une expression optimale du FVIII dans des vecteurs non viraux a révélé que la combinaison de l’amplificateur chimère HCR-1/HCR-2 et du promoteur ubiquitaire CMV (cytomégalovirus) a conduit à une augmentation de l’expression du facteur par rapport au promoteur seul.⁽²⁴⁾

Les introns peuvent également être utilisés pour optimiser l’expression des transgènes. Dans une étude visant à optimiser les vecteurs rAAV pour la thérapie génique dirigée vers le foie, l’ajout d’un intron entre le promoteur et le transgène a entraîné  une plus grande expression du transgène, cet effet étant plus apparent avec l’intron du virus minute de la souris (MVM, de la famille des virus parvovirus).^(25,26)

Une autre considération concerne la biologie des transgènes à ADN simple brin délivrés par l’AAV. Après l’introduction dans le noyau, le transgène à ADN simple brin doit être converti en transgène à ADN double brin avant de pouvoir être exprimé.⁽²⁷⁾ Cette étape ralentit la vitesse d’expression du gène et peut être contournée en utilisant des vecteurs d’ADN auto-complémentaires, appelés scAAV (self complementary adeno-associated virus vector).⁽²⁷⁾ Le scAAV contient à la fois la séquence codante pour le facteur IX et la séquence complémentaire de la cassette d’expression du transgène.⁽²⁷⁾

En raison de la capacité d’encapsidation réduite des scAAV, cette approche n’est pas actuellement étudiée pour l’administration du transgène F8.^(2,27)